Ein Bericht aus unserem Laboralltag

Einleitung

Das Porcine Reproduktive und Respiratorische Syndrom (PRRS) gehört zu den wirtschaftlich bedeutendsten Schweinekrankheiten weltweit und verursacht allein in den USA jährliche Verluste von mehr als 400 Millionen Euro. Auch in Deutschland stellt PRRS, welches durch ein circa 50-65 nm großes, behülltes RNA-Virus aus der Familie Arteriviridae verursacht wird, ein großes Problem für die Schweinebestände dar und ein plötzlicher Krankheitsausbruch in einem bislang PRRS-freien Bestand kann durchaus existenzbedrohend sein.

 

Klinik

Charakteristisch für PRRS sind vorübergehendes Fieber und Atemprobleme infolge einer Lungenentzündung, welche mit einer Zyanose (Blauverfärbung) von Ohren, Bauch und Beinen sowie einer Schwellung der Augenlider einhergehen kann. Während in Mastbetrieben die Lungenerkrankungen mit verminderter Mastleistung im Vordergrund stehen, kommt es in Zuchtbetrieben hauptsächlich zu Fruchtbarkeitsstörungen sowie zu erhöhten Ferkelverlusten durch Fehlgeburten (Spätaborte) und lebensschwache Ferkel.

Umso wichtiger ist daher eine effiziente, umfassende und nachweisempfindliche Diagnostik, vor allem im Hinblick auf die Untersuchung solcher Tiere, die von außen in einen freien Bestand eingestellt werden sollen.

 

Grundlegendes zur PRRS-Diagnostik

Prinzipiell kann bei der PRRS-Diagnostik zwischen indirekten und direkten Nachweismethoden unterschieden werden. Mit den indirekten Nachweismethoden können Antikörper nachgewiesen werden, welche vom Organismus gegen das Virus gebildet wurden. Hierfür wird hauptsächlich die ELISA-Technik angewandt. Beim direkten Nachweis versucht man das Virus selbst oder zumindest Teile davon nachzuweisen. Seit einigen Jahren ist hier die sogenannte Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) die Methode der Wahl, da durch sie bereits kleinste Mengen des Virusgenoms (RNA) detektiert werden können. Mittels PCR und anschließender Sequenzierung können darüber hinaus auch Aussagen gemacht werden, um welchen Genotyp (EU/US) es sich handelt, ob ein Feld- oder Impfvirusstamm vorliegt und ob dieses Virus bereits bei früheren Ausbrüchen schon einmal nachgewiesen wurde (Epidemiologie).

 

Im Folgenden sollen deshalb einige wichtige Schritte für eine effiziente PRRS-Diagnostik aufgezeigt sowie die dabei entscheidenden Kriterien deutlich gemacht werden (Abbildung 1).

Abbildung 1: 7 wichtige Schritte für eine effiziente PRRS-Diagnostik.

 

SCHRITT 1: Risikoanalyse im Betrieb

Bei der Erstuntersuchung eines Bestandes ist es sinnvoll, sich zunächst einmal die betrieblichen Gegebenheiten genauer anzuschauen. Gibt es klinische Anzeichen, die auf ein PRRS-Geschehen hinweisen? Welche Tiergruppen sind betroffen? Wie konsequent ist die Altersgruppentrennung? Könnte es Viruseinträge von außen geben oder handelt es sich um eine innerbetriebliche Viruszirkulation? Wird gegen PRRS-Virus geimpft und welches Impfschema kommt zur Anwendung? Erst wenn all diese Fragen beantwortet sind, kann entschieden werden, in welchen Stallbereichen und bei welchen Tieren eine Beprobung sinnvoll ist. Grundsätzlich ist die Vergesellschaftung von Tieren mit unterschiedlichem Infektions-/Immunstatus problematisch. Dieses findet insbesondere nach dem Absetzen statt, wenn Ferkel unterschiedlicher Sauen oder aus verschiedenen Betrieben in einem Raum eingestallt werden. Erfahrungsgemäß sind vor allem solche Ferkel als potentielle Virusausscheider zu betrachten, die entweder von Jungsauen abstammen oder aus Würfen mit lebensschwachen Ferkeln/Totgeburten kommen. Abbildung 2 zeigt beispielhaft die Bereiche eines Betriebes, der seine Jungsauen selbst nachzieht und in dem keine PRRS-Impfung durchgeführt wird. Hier sind es in erster Linie das Flatdeck sowie der Mastbereich, in denen eine Viruszirkulation wahrscheinlich ist.

Abbildung 2: Beispiel für eine Risikoanalyse im Betrieb.

 

SCHRITT 2: Bestimmung der geeigneten Untersuchungsmethode und -  matrix

Wurde die Risikoanalyse im Bestand durchgeführt, ist als nächstes festzulegen, worauf im Bestand untersucht werden soll (z.B. Antikörper oder Virusgenom) und welche Matrix (z.B. Blut oder Tupfer) sich dafür am besten eignet. Im oben genannten Beispiel wäre zur Diagnosestellung eine Beprobung von Sauen sinnvoll, die einen Spätabort hatten oder bei denen vermehrt lebensschwache Ferkel / Totgeburten beobachtet wurden. Die entnommenen Blutproben würden serologisch auf Antikörper gegen PRRSV untersucht werden. Bei positivem Befund sollte eine Untersuchung sowohl der Sauen als auch der Flatdeckferkel mittels PCR durchgeführt werden.
Eine Absprache zwischen praktischem Tierarzt und Labordiagnostiker ist von Vorteil, um die größtmögliche Aussagekraft zu erzielen.

 

Abbildung 3 zeigt mögliche Kombinationen von Proben- und Untersuchungsarten sowie weitere Differenzierungsschritte bei der PRRS-Diagnostik.

Abbildung 3: Übersicht über mögliche Proben- / Methodenkombinationen.

 

SCHRITT 3: Berechnung der optimalen Probenanzahl

Normalerweise möchte der Untersucher einen potentiell im Bestand vorkommenden Erreger mit einer möglichst hohen Wahrscheinlichkeit nachweisen. Wie viele Proben dafür notwendig sind, hängt aber ganz entscheidend von 2 Punkten ab: Wie hoch ist der Prozentsatz infizierter Tiere im Bestand (Prävalenz) und wie groß ist der Bestand insgesamt? Abbildung 4 macht deutlich, wie sehr die erforderlichen Probenzahlen vor allem bei niedrigen Prävalenzen von diesen Faktoren abhängen. So müssen in einem Bestand, in dem voraussichtlich nur wenige Tiere infiziert sind, wesentlich mehr Proben für die gleiche Nachweissicherheit untersucht werden, als in einem Bestand mit hohem Durchseuchungsgrad.

 

Abbildung 4: Einflussfaktoren auf die optimale Probenzahl (Konfidenz: 95%).

Notwendige Probenzahlen in Abhängigkeit von Bestandsgröße und Prävalenz	Anteil erkrankter Tiere (%) in einer Population (=Prävalenz)
Bestandsgröße	50,0	5,0	0,5
10	4	10	10
100	5	44	100
1000	5	57	450
10000	5	59	581

 

 

SCHRITT 4: Schneller und schonender Probentransport ins Labor

Jede noch so gute und empfindliche Untersuchung kann nicht funktionieren, wenn das eingesandte Material bereits in einem schlechten Zustand ist. Ganz besonders trifft dies für den molekularbiologischen Nachweis von PRRS-Viren zu, da deren Genom als RNA-Strang vorliegt und dieser äußerst empfindlich und instabil gegenüber äußeren Einflüssen ist. Insbesondere sogenannte Ribonukleasen (RNasen), d.h. Enzyme, welche die RNA spalten können und die in der Umwelt allgegenwärtig sind, führen zu einem raschen Abbau der Virus-RNA und somit zu einem falsch negativen Ergebnis. D.h. Proben, die im Labor auf PRRS-Viren untersucht werden sollen, müssen schnellst möglich im gekühlten / gefrorenen Zustand transportiert oder noch vor dem Transport mit speziellen Reagenzien (RNA-Stabilisierung / Hemmung von Bakterien) versetzt werden.

 

SCHRITT 5: Effiziente Nukleinsäure-Aufreinigung

Vor jedem molekularbiologischen Nachweis muss zunächst der Bauplan (Genom) eines Erregers, im Falle der PRRS-Viren eine RNA, isoliert werden. Hierfür stehen verschiedene Möglichkeiten zur Verfügung, die jeweils ihre Vor- und Nachteile in Bezug auf Effizienz, Dauer, Umsetzbarkeit oder Kosten haben. Wie unterschiedlich die Effizienz verschiedener Aufreinigungs-Verfahren sein kann, verdeutlicht Tabelle 1 anhand ausgesuchter negativer Beispiele aus unseren eigenen Validierungs-Untersuchungen. Verglichen wurden insgesamt 8 verschiedene automatisierbare RNA-Aufreinigungs-Kits auf Magnetpartikel-Basis, von denen allerdings nur 4 Kits in Tabelle 1 aufgeführt sind (A, B, C, E). Als „Goldstandard“ und somit als Referenz diente ein manuelles Aufreinigungs-Kit, mit dem wir seit vielen Jahren gute Erfahrungen haben. Zur besseren Vergleichbarkeit wurde nach allen Aufreinigungsmethoden dieselbe PCR durchgeführt. Spalte I zeigt die ct-Werte verschiedener Proben, die aus der Aufreinigung mittels Goldstandard resultieren. In Spalte II sind die entsprechenden ct-Werte der „Magnetic Bead“-basierten Kits aufgeführt. Je niedriger der ct-Wert, desto effizienter war die Aufreinigung und desto mehr Nukleinsäure konnte isoliert werden. Eine gründliche Validierung und Optimierung der Aufreinigung spielt somit für das spätere Ergebnis eine entscheidende Rolle!

 

Tabelle 1: Ct-Wert-Unterschiede von Proben nach Aufreinigung mit verschiedenen Kits.

Versuch Nr.	Matrix	PRRS-Typ	I Ct-Wert Goldstandard	II Ct-Wert Magnetpartikel-Kits	Ct-Wert- Differenz zwischen I + II	Kit
1	Serum	EU	22,0	28,9	6,9	A
2	Organ	EU	23,1	29,1	6,0	E
3	Organ	US	31,1	38,2	7,1	A
4a	Organ	EU / US	30,8 / 27,1	39,5 / 31,4	8,7 / 4,3	A
4b	Organ	EU / US	30,8 / 27,1	39,5 / 33,4	8,7 / 6,3	B
4c	Organ	EU / US	30,8 / 27,1	33,2 / 31,1	2,4 / 4,0	C
5	Organ	PRRS_gesamt	26,9	30,8	3,9	A
6	Serum	US	24,3	28,8	4,5	B
7	Organ	EU	23,0	34,3	11,3	B

Spalte (I..): Ct-Werte der Referenzmethode (Silikamembran/Säulchen/Zentrifugation).

Spalte (II.): Ct-Werte der Vergleichsmethode (hier: Kit A,B,C, E / Magnetic Beads / automatisiert).

Spalte (D): Ct-Wert-Unterschiede zwischen Referenz- und Vergleichsmethode.

 

SCHRITT 6: Untersuchung mit aktueller und ggf. optimierter PCR-Methode

Die große Herausforderung für eine empfindliche und viele verschiedene Feldisolate umfassende PRRS-Diagnostik liegt vor allem darin, dass PRRS-Viren eine extrem hohe Mutationsrate in ihrem Genom aufweisen. Optimalerweise sollte deshalb eine Methode zur Verfügung stehen, mit der einerseits die extrem hohe Anzahl unterschiedlicher Feldisolate „herausgefischt“ werden kann („Screening“), die zum anderen aber auch eine rasche Differenzierung zwischen den Genotypen I + II (EU- und US-Typ) sowie zwischen Impf- und Feldstämmen ermöglicht. Des weiteren wäre eine Feindifferenzierung der unterschiedlichen Feldstämme wünschenswert, um somit auch epidemiologische Aussagen treffen und die aktuelle Diagnostik an die neu entdeckten Feldstämme anzupassen zu können.
Solch eine Diagnostik muss für Einzeltier- und Bestanduntersuchungen geeignet sein und die Isolierung von Virus(genom) sollte aus den unterschiedlichsten Organen möglich sein.
Um die Eignung verschiedener kommerzieller PCR-Kits für diese Anforderungen zu prüfen, wurden insgesamt 811 Proben (Serum, Organe, Sperma, Lavage, Tupfer) mit bis zu 6 verschiedenen Methoden (1x Literaturmethode, 5x kommerzielle Anbieter) untersucht. Die Ergebnisse der 4 besten Kits (A-D) im Hinblick auf den Genotyp I (EU-Typ) zeigt Tabelle 2. Es fällt auf, dass es einen relativ großen Anteil an Proben gibt (32 von 811 / 3,9%), bei denen die Ergebnisse der unterschiedlichen PCR-Kits voneinander abweichen. Aus den Ergebnissen kann auch geschlossen werden, dass sich nicht alle auf dem Markt angebotenen PCR-Kits gleichermaßen für die PRRS-Diagnostik eigenen. Angebotene Testkits sollten sehr genau geprüft und bezüglich ihrer Empfindlichkeit und Sicherheit miteinander verglichen werden.

 

Tabelle 2: Vergleich kommerzieller PCR-Kits zum Nachweis von PRRS-Virus (EU-Typ).

	Probenanzahl	PCR-Kit
		A	B	C	D
Proben mit ausschließlich negativen Ergebnissen bei allen PCR-Kits	44	negativ
	345	negativ
	10	negativ			negativ
	16	negativ
	230	negativ		negativ
	645 x
Proben mit ausschließlich positiven Ergebnissen bei allen PCR-Kits	11	positiv
	75	positiv
	2	positiv			positiv
	39	positiv		positiv
	7	positiv
	134 x
Proben mit positiven + negativen Ergebnissen bei verschiedenen PCR-Kits	6	positiv	positiv	positiv	negativ
	3	positiv	negativ	positiv	negativ
	2	positiv	negativ	positiv
	1	positiv	positiv		negativ
	2	positiv	positiv	negativ
	2	negativ	positiv	positiv
	4	positiv	negativ	negativ
	3	negativ	positiv	negativ
	1	negativ	negativ	positiv
	2	positiv		negativ
	6	negativ		positiv
	32 x
Anzahl untersuchter Proben	811 (gesamt)	811 (Kit A)	534 (Kit B)	775 (Kit C)	77 (Kit D)

 

= Proben wurden mit diesem PCR-Kit nicht untersucht.

 

SCHRITT 7: Genomsequenzierung zur Erkennung neuer Feldisolate

Wurde das PRRS-Virus im ersten Schritt durch eine Screening-PCR nachgewiesen, kann im weiteren Verlauf der Untersuchungen mittels Sequenzierung eine Subtypisierung der gefundenen Virus-Isolate durchgeführt werden. Zum einen ist dadurch eine epidemiologische Zuordnung möglich, zum anderen können mit dieser Methode schon frühzeitig neue Genommutationen erkannt und somit die Screening-Methoden angepasst werden. Abbildung 5 zeigt den Ablauf solch eines Procederes, bei dem die diagnostischen Methoden kontinuierlich an die neuen Anforderungen angepasst werden.

Abbildung 5: Kontinuierliche Anpassung der Screening-PCR an neue Virusisolate.

 

Eine effiziente und erfolgversprechende PRRS-Diagnostik kann also nur erreicht werden, wenn die einzelnen Schritte bereits im Vorfeld überdacht wurden und ein entsprechendes Konzept erstellt wird. Nur durch ein risikoorientiertes und engmaschiges Beprobungs- und Diagnostiknetz können die Erreger effizient aufgespürt und die notwendigen Schritte eingeleitet werden.

 

Danksagung

Wir danken den Mitarbeitern des SGD Stuttgart für ihre fachliche Unterstützung und ihre konstruktiven Vorschläge.

 

Weitere Informationen im Internet

• Bundesamt für Veterinärwesen BVET (Schweiz).

http://www.bvet.admin.ch/gesundheit_tiere/01065/01083/01106/index.html

 

Download:

 

Bildnachweis:

CVUA Stuttgart.

 

 

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Autor(en): Dr. Marc Hoferer

 

Bericht erschienen am 13.09.2012 15:45:05

Zuletzt aktualisiert am 13.09.2012 15:55:58