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Untersuchung von Proben auf Rückstände von Pflanzenschutzmitteln

Seit 01.01.2002 wird in Baden-Württemberg die Untersuchung auf Rückstände an Pflanzenschutzmitteln zentral an zwei Untersuchungsämtern durchgeführt. Für pflanzliche Lebensmittel erfolgen die Untersuchungen am Chemischen und Veterinäruntersuchungsamt (CVUA) in Stuttgart und für tierische Lebensmittel am CVUA Freiburg. Dabei wächst die Anzahl von Pestizidwirkstoffen auf dem Weltmarkt ständig. Etwa 1.000 Pestizidwirkstoffe werden von der Lebensmittelüberwachung im CVUA Stuttgart routinemäßig erfasst.

 

Um in Lebensmitteln die Überwachung der wachsenden Anzahl verschiedenster Pestizidwirkstoffe mit einem breiten Spektrum chemischer Eigenschaften möglichst umfassend gewährleisten zu können, müssen bestehende Untersuchungsverfahren ständig für neue Stoffe optimiert werden oder gänzlich neue Verfahren entwickelt werden. In Verbindung mit den niedrigen Konzentrationen, in denen die Rückstände in Lebensmitteln auftreten, ist ihre Analytik sehr anspruchsvoll. Neben viel Know-how und einer ständigen Weiterentwicklung der analytischen Messmethoden sind auch modernste analytische Geräte unabdingbar. Nur so kann eine umfassende und präzise Bestimmung der Pestizidrückstände gewährleistet und der Verbraucherschutz wirksam durchgeführt werden.

 

Die meisten Laboratorien bedienen sich zur Aufarbeitung von Proben für die Pestizidsrückstandsuntersuchung der sogenannten Multimethoden wie beispielsweise QuEChERS und QuPPe. Dabei wird eine sehr große Anzahl von Wirkstoffen mit einer einzigen Aufarbeitung erfasst und für die eigentliche Messung vorbereitet. Dabei kommen unterschiedlichen Messmethoden zum Einsatz, die jeweils auf bestimmte Pestizidwirkstoffe abgestimmt sind.

 

Zusammengefasst erfolgt die routinemäßige Untersuchung der Proben auf Pestizidrückstände und Kontaminanten am CVUA Stuttgart derzeit in den folgenden Arbeitsschritten :

  • Probenvorbereitung
    • Probenbeschreibung, Sinnesprüfung
    • Probenzerkleinerung Homogenisierung und Probeneinwaage
  • Probenaufarbeitung (über die zwei Multimethoden QuEChERS und QuPPe)
    • Extraktion der Pestizidrückstände mit organischen Lösungsmittel
    • Reinigung der gewonnenen Extrakte (nicht bei QuPPe) mit nach Probenmatrix variierenden Cleanup-Methoden
  • Messung der gereinigten Extrakte
    • Auftrennung von Substanzen über gas- und flüssigkeitschromatographische Trennverfahren mit für Substanzgruppen speziell angepassten Methoden
    • Direkte Identifizierung und vorab Quantifizierung der getrennten Substanzen mit verschiedenen Detektorsystemen
    • Auswertung der Ergebnisse
  • Präzise Quantifizierung (bei relevanten Erstbefunden)
    • Erneute, zweifache Aufarbeitung (Doppelbestimmung) der zerkleinerten Probe, ggf. mit Isotopen markierten Standardsubstanzen (als sog. interne Standards)
    • Auftrennung, Messung und spezielle Auswertung (Standardadditionsverfahren)

 

Probenvorbereitung

Probenbeschreibung

Bei der Probenbeschreibung werden Probenmenge, Chargeneinheit, Probenzustand und die für die jeweilige Angebotsform notwendigen Pflichtangaben wie Herkunftsland oder Mindesthaltbarkeitsdatum überprüft.

 

Probenmenge und Chargeneinheit

Rückstandsgehalte die im weiteren Verlauf der Probenuntersuchung erhalten werden sollen nicht nur dem Rückstandsgehalt in der tatsächlich untersuchten Probe entsprechen, sondern möglichst den Rückstandsgehalt der gesamten Charge einer Produktion widerspiegeln. Dafür muss eine bestimmte Mindestprobenmenge für die Untersuchung zur Verfügung stehen, die gemäß statistischen Berechnungen bestimmt wurde (in der Regel 1 kg und/oder 10 Probenstücke). Als Grundbedingung müssen alle Bestandteile der Probe von derselben Charge sein. Diese und weitere Vorgaben für die Probenahme sind in der Richtlinie 2002/63/EG und der Amtlichen Sammlung von Untersuchungsverfahren festgelegt (§ 64 Abs. 1 des Lebensmittel- und Futtermittelgesetzbuches (LFGB), Gliederungsnummer L 00.00-7 (EG)).

 

Probenzustand

Zur Einschätzung des Probenzustandes wird die Probe genau betrachtet, der Geruch überprüft, die Probeteile aufgeschnitten und verkostet. Der Zustand der Probe wir dabei schriftlich und mit Fotos festgehalten. Das Augenmerk liegt dabei auf sensorischen Auffälligkeiten wie beispielsweise Schimmel, Fäulnis, ranzigem Geruch oder Geschmack. In Einzelfällen, etwa wenn beim Aufschneiden der Probe Insektenbefall festgestellt wird, können Proben nach der sensorischen Betrachtung ohne weitere Untersuchung beanstandet werden. Ist die Probe zu großen Teilen sichtlich verdorben, wird sie ebenfalls nicht auf Pestizidrückstände untersucht, da beim Verderbsprozess Pestizidrückstandsgehalte beeinträchtigt werden können. Schimmelpilze etwa sind in der Lage Pestizidwirkstoffe durch ihren Stoffwechsel abzubauen, so dass ein Untersuchungsergebnis in einem solchen Fall keine Aussagekraft hat.

 

Herkunftsland

Das Herkunftsland ist für die Beurteilung möglicher Pestizidrückstandsgehalte besonders wichtig, da jeder EU-Mitgliedsstaat auf Grund der dort vorherrschenden klimatischen Bedingungen und der angebauten Kulturen selbst die Zulassung für Pestizidwirkstoffe durchführt. Diese Vorschriften bezüglich der Anwendung von Pestiziden und ihren Wirkstoffen unterscheiden sich ggf. von denen anderer Mitgliedsstaaten der Europäischen Union. So können Proben bei Angabe des Herkunftslandes Deutschland neben den EU-Vorgaben auch auf die Einhaltung nationaler Vorschriften geprüft werden. Es kommt vor, dass auf Produkten mit der Herkunft „Deutschland“ geworben wird, die Art der festgestellten Pestizidrückstände jedoch auf ein Drittland schließen lassen. In einigen derartigen Fällen konnte eine falsche Herkunftsangabe anhand der Untersuchungsergebnisse in Zusammenarbeit mit den zuständigen unteren Lebensmittelüberwachungsbehörden bereits aufgedeckt werden.

 

Kennzeichnungsvorschriften

Insbesondere bei Fertigpackungen, die in Abwesenheit des Verbrauchers verschlossen wurden und die nicht zum unmittelbaren Gerbrauch bestimmt sind, gibt es einige Pflichtangaben, deren Vorhandensein auf dem Etikett der Probe überprüft werden muss. Diese und andere Vorgaben zur Kennzeichnung sind seit dem 13. Dezember 2014 überwiegend in der Lebensmittelinformationsverordnung (LMIV) festgelegt.

 

Probenzerkleinerung, Homogenisierung und Einwaage

Proben für die Pestizidanalytik werden zuvor nicht gewaschen, da dies den Gehalt einiger Rückstände auf den Proben reduziert. Bestimmte Teile von Proben entsprechend den Angaben in der Pestizidrückstände-Höchstgehaltsverordnung (VO (EG) 396/2005) werden jedoch nicht mit untersucht. Beispielsweise müssen bei Erdbeeren die Blätter entfernt werden und auch Trauben werden ohne die Rispen untersucht. Wie die richtige Probenmenge sind auch die vorschriftsgemäße Zerkleinerung und anschließend die sorgfältige Homogenisierung entscheidend für die Repräsentativität der Untersuchungsergebnisse. Während bereits fein gemahlenes Getreide i.d.R. nicht weiter zerkleinert werden muss, wird z. B. bei Steinobst-Produkten vor der groben Zerkleinerung der Kern entfernt, gewogen und bei der Berechnung der Pestizidgehalte wieder mit berücksichtigt. Lange, dünne Gemüse hingegen werden in fünf gleichlange Stücke geschnitten, wobei nur die zwei Endstücke und das Mittelstück für die Homogenisierung verwendet werden. Größere Produkte wie beispielsweise Äpfel werden nach dem Sektorverfahren viergeteilt und jeweils die zwei gegenüberliegenden Seiten für die Analyse weiter verarbeitet (siehe auch Abb. 1a–1d). Diese Empfehlungen wurden von der Gesellschaft Deutscher Chemiker (GDCh) erarbeitet und werden am CVUA Stuttgart seither angewendet.

 

Abbildungen 1a-1d: Probenzerkleinerung, u.a. Sektorverfahren.

Abbildungen 1a–1d: Probenzerkleinerung, u.a. Sektorverfahren

 

Nachdem die grob zerkleinerten Probenteile über Nacht tiefgefroren wurden, können sie am nächsten Morgen in gefrorenem Zustand mit Trockeneis im Mixer zu einer möglichst feinkörnigen, homogenen Masse zerkleinert werden (cryogenic milling). Diese homogene Masse wird dann je nach Probenart zu 1 g bis 10 g für die Probenaufarbeitung in die entsprechenden Extraktionsgefäße eingewogen (siehe auch Abb. 2a–2c).

 

Abbildung 2a-2c: Einwaage homogener Probemasse in Extraktionsgefäß.

Abbildung 2a–2c: Einwaage homogener Probemasse in Extraktionsgefäß

 

Probenaufarbeitung

Ein großer Fortschritt in der modernen Pestizidrückstandsanalytik ist, dass für über 99 % der zu untersuchenden Rückstände nur zwei unterschiedliche Aufarbeitungsmethoden verwendet werden können. Die sogenannten Multimethoden erlauben es also eine große Anzahl von Wirkstoffen in deutlich verkürzter Zeit und geringem Materialaufwand für die Untersuchung aufzuarbeiten. So werden chemisch wenig oder mittel-polare Wirkstoffe mit der QuEChERS-Methode aufgearbeitet, während bei chemisch polareren Substanzen die QuPPe-Aufarbeitungsmethode angewendet wird. Beide Methoden wurden von einem Mitarbeiter des CVUA Stuttgart entwickelt und werden mittlerweile in Laboren auf der ganzen Welt angewendet.

 

Dennoch unterscheiden sich Pestizidwirkstoffe in ihrer Chemie erheblich voneinander. So gibt es Pestizidrückstände, die in einem sauren Extrakt mit niedrigem pH-Wert sehr schnell abbauen, in einem neutralen oder leicht alkalischen Extrakt mit höherem pH-Wert jedoch über längere Zeit stabil sind. Damit ein Probenextrakt in diesem Fall für die Messung eines bestimmten Wirkstoffes verwendet werden kann, muss der pH-Wert der Aufarbeitungsmethode angepasst werden. Bei von sauren Proben, wie beispielsweise Zitronen oder Granatäpfeln, wird beispielsweise vorbeugend etwas alkalische Natronlauge zugegeben. Dadurch bleibt der pH-Wert in einem akzeptablen Bereich und der Pestizidrückstand kann ohne Verluste gemessen werden.

 

Auch die Probenmatrix, in der die Pestizidrückstände nachgewiesen werden sollen, besitzt großen Einfluss auf die Qualität der Ergebnisse in der Rückstandsanalytik. Damit z. B. der bei Kräutern stark grün gefärbte Extrakt richtig analysiert werden kann, muss der grüne Farbstoff „Chlorophyll“ aus dem Extrakt zusätzlich entfernt werden (siehe auch Abb. 3). Dazu wird spezielles Kohlepulver (Aktivkohle) zugegeben, an dem der Farbstoff bindet und daraufhin in einer Zentrifuge zusammen mit der Kohle vom gereinigten Extrakt abgetrennt werden kann.

 

Abbildung 3: Farbige QuEChERS-Extrakte.

Abbildung 3: Farbige QuEChERS-Extrakte

 

So sind probenabhängige und rückstandsspezifische Anpassungen der zwei Aufarbeitungsmethoden zwar erforderlich aber dennoch mit nur begrenztem Aufwand verbunden. Die Analyse und Auswertung der komplexen Ergebnisse im Anschluss an die Aufarbeitung erfordern darüber hinaus zusätzliche Erfahrung und viel Know-how.

 

Messung der gereinigten Extrakte

Im Anschluss an die Probenaufarbeitung werden die chemisch sehr unterschiedlichen Pestizidwirkstoffe gruppenweise an mehreren Messgeräten und mit verschiedenen spezifischen Messmethoden untersucht. Durch diese Aufteilung auf verschiedene Geräte und Messmethoden können Pestizidrückstände in den Proben verlässlich identifiziert und eine vorab Quantifizierung durchgeführt werden. Bei positiven Befunden nahe an Grenzwerten oder bei einem Befund unerlaubten Substanzen erfolgt nachträglich eine präzisere Quantifizierung in einem aufwendigeren Verfahren.

 

Für die Trennung verschiedener Pestizidrückstände voneinander und von Bestandteilen der Probe (Untersuchungsmatrix), die mit in den Extrakt übergegangen sind, werden hauptsächlich zwei chromatographische Trennverfahren angewendet: die Gas- und die Flüssigkeitschromatographie. In beiden Fällen hat man eine feste (LC) bzw. eine flüssige, fixierte(GC) Trennsubstanz in der die Auftrennung erfolgt (Trennphase). Zusätzlich braucht ist eine weitere Phase notwendig, die Moleküle und Substanzen transportieren kann. Bei der Flüssigkeitschromatographie wird hierfür eine Flüssigkeit eingesetzt, bei der Gaschromatographie ein Gas.

 

Das einfachste Modell einer Flüssigkeitschromatographie stellt die Papierchromatographie dar. Dabei ist das Papier die feste Trennphase, während man Wasser oder ein Lösungsmittel als „Transportmittel“ d. h. als Fließmittel verwenden kann. So lassen sich beispielsweise die verschiedenen Farbstoffe, die in einem schwarzen (oder andersfarbigen) Filzstift enthalten sind, auftrennen (siehe Abb. 4).

 

Abbildung 4: Papierchromatographie von schwarzem Filzstift mit Methanol.

Abbildung 4: Papierchromatographie von schwarzem Filzstift mit Methanol

 

Man kann sich leicht vorstellen, dass ein dichteres oder grobkörnigeres Papier auch zu einem anderen Ergebnis führen kann. Genauso werden auch im Labor unterschiedliche feste Phasen eingesetzt, die speziell auf verschiedene Substanzgruppen angepasst sind. Auch die Temperatur, Fließgeschwindigkeit oder die Zusammensetzung der Fließmittel beeinflussen das Ergebnis der Auftrennung und werden für die jeweiligen Methoden optimiert.

 

Nach der Trennung mit einer der Trennmethoden erfolgt im direkten Anschluss die Identifizierung der Substanzen über verschieden Detektorsysteme. In den meisten Fällen besteht das Detektorsystem aus zwei miteinander gekoppelten Massenspektrometern (MS/MS), aber auch einzelne Massenspektrometer (MS) oder Flugzeitmassenspektrometer (TOF) werden zur Identifizierung der Substanzen genutzt.

 

Massenspektrometer fungieren als Massenfilter. Einfach gesagt werden Moleküle in einem MS ihrer Masse nach aufgetrennt. Über die Anzahl der gemessenen Moleküle erhält man zusätzlich die gemessene Signalstärke. Darüber kann eine erste Quantifizierung der untersuchten Substanzen erfolgen. Bei einem MS/MS-System werden die Moleküle nach der Trennung im ersten MS in kleinere Bruchstücke zertrümmert, die dann im zweiten MS gemessen werden. Da die entstehenden Molekülbruchstücke oft sehr spezifisch für die Ausgangssubstanz sind, aus der sie entstanden sind, ermöglicht das MS/MS-System eine noch verlässlichere Identifizierung von Substanzen.

Nach der Messung der Extrakte werden die Messergebnisse mit Hilfe von Kalibrierstandards und einem Auswerteprogramm für jeden Pestizidrückstand einzeln ausgewertet. Bei einem positiven Befund für einen Wirkstoff wird genau geprüft, ob der gefunden Gehalt nahe beim erlaubten Gehalt liegt oder diesen vielleicht sogar überschreitet. In diesem Fall muss der Pestizidgehalt nochmals in einem aufwendigeren Verfahren genauer bestimmt werden (präzise Quantifizierung). Dazu muss die Probe zweifach erneut aufgearbeitet werden (Doppelbestimmung).

 

Präzise Quantifizierung

Bei der erneuten Aufarbeitung von Proben zur präzisen Gehaltsbestimmung der Pestizidrückstände kommen spezielle analytische Verfahren zum Einsatz, die bei der ersten Untersuchung aus Zeit und Kostengründen nicht angewendet werden können. Durch diese zusätzliche Doppelbestimmung wird der vorab bestimmte Gehalt noch zweimal und präziser bestimmt und damit abgesichert. Das ist insbesondere dann notwendig, wenn ein Pestizidgehalt in der ersten Probenuntersuchung nahe am Grenzwert liegt oder ihn sogar überschreitet.

 

Das häufigste und sicherste Verfahren für die präzise Bestimmung von Rückständen (besonders in problematischen Matrices) ist die Standardaddition. Dabei werden verschiedener Mengen des Pestizidwirkstoffes (Analyt) zu der Probe zugegeben (sog. Aufstockung durch zu dotieren).

 

Zusätzlich können spezielle interne Standards (ISTD) zum Einsatz kommen, die im besten Fall die gleichen chemischen Eigenschaften haben wie der Analyt (z.B. mit Isotopen markierte Standards). Für die Berechnung wird der Rückstandsgehalt über das Flächenverhältnis von Analyt und internem Standard herangezogen. Die eigentliche Quantifizierung erfolgt über eine mathematische Berechnung die in Abbildung 5 schematisch angeführt ist. Die so erhaltenen Ergebnisse sind sehr genau und halten jeder Überprüfung stand.

 

Abbildung 5: Schematische Darstellung des Standardadditionsverfahrens.

Abbildung 5: Schematische Darstellung des Standardadditionsverfahrens

 

Verwendung der Analyseergebnisse – Messunsicherheit bei Pestizidrückständen in Obst und Gemüse

Bei der rechtlichen Bewertung von Rückstandsbefunden ist gemäß Document N° SANTE/2015/11945 der EU eine analytische Schwankungsbreite zu berücksichtigen, die bei pflanzlichen Proben 50 % beträgt, wie die Auswertung einer großen Zahl EU-weiter Laborvergleichsuntersuchungen von Pestizidrückständen ergeben hat.

Damit ist ein Grenzwert von 0,01 mg/kg aus Sicht des staatlichen Überwachungslabors i.d.R. erst ab einem Analysenergebnis von 0,021 mg/kg zu beanstanden (Messwert minus 50 %). Bei einem Gehalt unter 0,021 mg/kg kann hingegen eine Überschreitung der Höchstmenge nicht mit an Sicherheit grenzender Wahrscheinlichkeit (95 % Vertrauensintervall) angenommen werden.

 

Für die Importeur-, Erzeuger- und Anbieterseite bedeutet dies andererseits, dass die Höchstmenge im Rahmen der Eigenkontrolle nicht ausgeschöpft werden sollte. Damit die Ware mit an Sicherheit grenzender Wahrscheinlichkeit (95 % Vertrauensintervall) die lebensmittelrechtlichen Vorgaben einhält, sollte der Rückstandsgehalt in der Probe unter Berücksichtigung der Messunsicherheit im ungünstigsten Fall (Messwert plus 50 %) noch unter der Höchstmenge liegen.

 

Bericht erschienen am 19.01.2016 11:07:20

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